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伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕
时间:2018-06-27 17:53  点击数:92次
前言
     伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带,然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察;这些边缘的细胞会开始进行迁移活动,并且最终覆盖整个无细胞的区域,重新互相接触在一起。
 
 
传统实验方法
     细胞在培养皿内贴壁后,使用移液枪的枪头在贴壁细胞的中间划过,人为造成一道伤口(划痕),之后定时测量划痕的宽度,进而得到伤口愈合的细胞迁移数据。
 
实验缺点:
1.手动划痕,不能保证每次划痕的一致;
2.有时候在划细胞的同时会刮坏一片细胞,对划痕的边缘的细胞造成机械损伤;
3.如果培养皿底部还有包被蛋白的话,枪头划过,很可能伤害到包被,进而影响到细胞迁移,结果便很难判断是哪个因素造成了决定性的影响。
4.定时测量划痕的宽度,计算划痕宽度随时间推移的变化;在选取划痕测量点时,不可避免地引入了主观误差(人为选取了迁移结果符合实验预期的点);
 
       综上,传统的伤口愈合方法总是重复性不佳,对于实验结果的阐述说服力不足。
       下面分享一种新方法,轻松得到笔直均一的划痕!
 
实验核心
       使用伤口愈合插件制造笔直均一的划痕(图一)。
 伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕
 
实验方法     
一.实验材料
1) 细胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
2) 实验耗材:   ibidi 35 mm培养皿带伤口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
3) 细胞培养基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
4) 细胞消化试剂:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
5) 灭菌镊子
6) 倒置显微镜,如果需要进行连续的观测最好搭配镜载加热孵育系统
 
一.实验步骤
1.铺细胞(图二)
为了获得更好的实验结果,在做实验之前最好进行一次预实验,以确定需要使用的细胞悬液的密度。我们建议,最好将细胞悬液密度调整为24小时后正好可以长满每个插件的小孔。
● 将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
● 准备细胞悬液,调整悬液浓度为3*105 cells/ml,这样24小时后,细胞能刚刚长满单个小孔。
● 在ibidi细胞插件的每孔中加入70μl的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
● 在37。C培养箱中孵育24小时。
 
伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕 
图二:A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。
 
1.形成“划痕”
当所有细胞都贴壁并且刚刚长满的时候,就可以开始伤口愈合实验了。用镊子将伤口愈合插件提出,之后加入新鲜的培养基,或者在培养基中加入刺激剂,然后观察伤口愈合的情况。
● 24小时后对细胞前一天种的细胞做镜检。细胞要贴壁并且是刚刚长满每个孔。长得过多移除插件时会带走很多细胞,长得过少,伤口愈合的效果很差。
● 如图三所示,小心的用镊子夹住插件的一个角,将插件移除。 
           伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕
图三:用镊子移除插件
● 移除插件后,要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”(图四)。
● 小心的清洗细胞,之后加入2ml培养基进行培养。
伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕 
图四 笔直均一的划痕
 
1.采集并分析图像
一般伤口愈合实验都是采集一张“划痕”的初始图像,再在实验结束时候采集一张“划痕”愈合的图像。我们建议可以在这个过程多做几个时间点,这样可以观测到细胞迁移随时间的变化特征。
● 在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像,“划痕”的方向最好在视野内为水平的或者垂直的。
● MCF-7细胞每半小时采集一张图片,一直持续到20小时。
● 采用ibidi伤口愈合分析软件,统计细胞的覆盖面积,做出曲线图,可以看到在大约11个小时的时候,细胞基本就已经长满了,接下来几个小时细胞覆盖面积都不会发生变化(图五)。
伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕 
图五(a)  显微镜下观察细胞覆盖面积的变化
伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕 
图五(b)  细胞覆盖面积的数据统计
 
 
实验总结对比
1.本实验方法能得到重复性更好的划痕(图六);
伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕
图六 通过计算划痕的面积可以看出,在多次实验中,枪头划痕(左图)
 
制造的划痕面积数据波动大,重复性差;ibidi伤口愈合插件(右图)制造的划痕面积数据统一,重复性良好
 
2.不会刮坏细胞,也不会造成划痕的边缘的细胞有机械损伤;
 
3.不会伤害到培养皿底部的包被蛋白;
 
 伤口愈合/细胞划痕实验新方法-如何划出笔直均一的划痕      
 
图一:左图表示枪头划过后,底部包被蛋白被划伤,细胞迁移结果受到底部不均一的影响。右图ibidi插件移除后底部的包被蛋白没有被破坏。
 
4.通过计算细胞覆盖面积得出细胞迁移结果,避免人为选取测量点,使数据更客观。1天内就能得到测量结果,实验分析更快更准确。
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