表三：制备1.6mg/ml 基质胶

 

操作步骤：

●使用表一中的培养基制备  9 x 106 cells/ml 的细胞悬液

●在1.5ml离心管中小心混匀表三中的1和2号试剂，避免产生气泡

●在另一1.5ml离心管中准备150 μl  collagen 

●使用200μl枪头从第二步的混合液中吸取30μl（图一A）

●小心混匀（图一B），避免产生气泡

●加入90μl细胞悬液到上一步混合液中（图一C）

●小心混匀（图一D），避免产生气泡

图一：制备细胞-基质胶混合液图示，注意：1）避免产生气泡，气泡会破坏胶原纤维，不能使用Vortex；2）胶原混合后，离胶凝大约有5分钟时间，如果在凝胶后再进行操作会破坏胶原纤维；3）当刚加10x MEM到NaHCO3中的时候会看到颜色变化，这表明没有充分反应，因此加入混合液到胶原蛋白中后要充分混匀。

 

二.细胞趋化实验

 

1.趋化试剂

●化学趋化物：CCL 19（1.25 μg/ml in RPMI 1640/10%FCS）

●无化学趋化物培养基：RPMI1640，10%FCS

 

2.实验步骤

 

●当细胞-基质胶混合液制备好后直接加入ibidi细胞趋化载玻片的中间通道中（图二）

 

                                        图二，在观测通道中加入细胞-基质胶混合液

●将细胞趋化载玻片放入培养箱中30-35分钟，等待胶原蛋白凝固

●胶凝固后，分别在两边储液池中加入60μl的化学趋化物和无化学趋化物培养基作为细胞趋化实验（+/-）（图三）

                        图三：加入化学趋化物（红色）和无化学趋化物培养基（蓝色）

●在两边储液池中均加入60μl的无化学趋化物培养基作为空白对照（-/-）（图四）

                                  图四：加入无化学趋化物培养基（蓝色）作为空白对照

 

●按说明，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集

●将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，进行4小时的观测，每2分钟采集一张图片

 

图五：明场1小时处图像采集，由于是3D培养环境，不是所有的细胞都能被清楚的成像。

 

三.图像处理

1.手动细胞轨迹追踪

●下载ImageJ，并安装Manual Tracking模块

●导入采集的系列图像到ImageJ中，打开模块“Manual Tracking”，选择“Add track”开始记录细胞轨迹

●选择一个细胞，按照时间点单击细胞，第一点击后，会有新窗口跳出来显示初始位置，以后每次点击，都将在这个新窗口中产生一个该细胞随着时间的新坐标

●统计完足够的细胞轨迹后，保存轨迹坐标表格

●至少收集30个细胞的轨迹才具有统计学意义，避免同一细胞追踪两次，去除由于凋亡会而不能采集完整的轨迹的细胞

●可以将“Overlay dots & lines”以.avi格式导出

 

2）全自动细胞轨迹追踪

使用ibidi的WimTaxis自动分析平台，将采集的系列图像上传到该平台，几个工作日后，会得到细胞轨迹的坐标表格数据结果。

 

四、数据处理

 

使用迁移指数（ Forward Migration Indices*，FMIs）作为比较趋化实验和对照试验的参数。在有趋化物的情况下，空白对照的FMI和与趋化物垂直方向的化学趋化的迁移指数（FMI┴）应是在0点左右。而与趋化物平行方向的化学趋化的迁移指数（FMI‖）与0点有显著的区别表现出了化学趋向性。同时，使用Rayleigh Test**对细胞趋化的方向性进行检验。如果p值大于0.05表示了细胞运动的无序性，表明没有方向性的迁移。此外，迁移速率等参数也能直接用于分析。

*Foxman et al. Integrating conflicting chemotactic signals. The role of memory in leukocyte navigation, J Cell Biol 147, 577-588 (1999)  

**Fisher, N. I. Statistical Analysis of Circular Data, Cambridge University Press, New York (1993) 

 

五、统计结果：

 

 

 

空白对照（-/-）

 

=>表面无序，无方向特异性迁移

 

六、实验优势总结

1.可实时观察细胞趋化情况；

2.可计算细胞的趋化速率；

3.在1组实验中即可做出连续性趋化浓度梯度；

4.建立的浓度梯度可维持长达48小时，对快速迁移细胞或慢速迁移细胞都适用；

5.可选配套的图像分析，轻松得到实验数据。