ibidi3孔/8孔/12孔可移除腔室载玻片可提供了一种简单且经济高效的免疫荧光实验方案，使用一片可移除的腔室载玻片进行细胞的培养，固定和染色，无需爬片，是倒置/正置显微镜以及长期样品储存的理想选择。

　　此次实验应用提供了一种使用ibidi8孔可移除腔室载玻片（80841）培养、固定和染色细胞的简单方案。培养MCF-7细胞并用福尔马林溶液固定。细胞核用DAPI染色，肌动蛋白骨架用DYE-490鬼笔肽染色。利用一级和二级抗体染色，通过免疫细胞化学可以探测其他细胞内结构。

　　实验使用的材料和试剂：　　

　　· 8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）　

　　· 可移除腔室载玻片用的盖玻片，24 x 60 mm（ibidi，10811）　　

　　· 细胞：MCF-7（CLS，300273）　　

　　· 细胞培养基　　

　　· 细胞培养试剂　　

　　· PBS缓冲液　

　　· 福尔马林中性缓冲液，10％（Sigma，HT5011）　　

　　· 染色试剂

　　· 封片剂：FluoroshieldTM（Sigma，F6182）　　

　　实验方案：　

　　细胞培养，固定，染色和成像观察--都是在一个开放型小室中搞定：）　　

　　步骤1：　　

　　必须在预实验中确定细胞系的正确接种浓度。根据您的细胞类型，用4-6x104细胞/ ml在2-3天内产生汇合的单层。　　

　　1.在无菌条件下，打开8孔可移除腔室载玻片（ibidi，80841）包装。　　

　　2.像往常一样用胰蛋白酶消化并计数细胞。细胞浓度为5×104细胞/ ml MCF-7。　　

　　3. 将400微升细胞悬浮液加入腔室的每个孔中。避免摇晃，因为这会导致细胞分布不均匀。　

　　4. 用配套的盖子盖住。在37°C和5％CO2下培养。细胞至少培养24小时，或直到建立融合的单层。　

　　步骤2：　

　　固定是染色程序的第一步。目标是将细胞，细胞形成物或组织维持在其当前状态，并在较长时间内通过化学试剂保存。　　

　　1.小心地吸出细胞培养基。　　

　　2.用PBS洗两次。　

　　3.加入400μl福尔马林溶液。　　

　　4.在室温下孵育30分钟。　　

　　5.小心吸入福尔马林溶液。　　

　　6.用PBS洗涤三次。　

　　步骤3：　

　　应根据感兴趣的细胞结构选择染色试剂。在该方案中使用DAPI和DYE-490鬼笔环肽染色MCF-7细胞的细胞核和肌动蛋白骨架。　　

　　1.准备你的染色溶液：

　　2.小心吸出PBS。　　

　　3.移取400μl染色溶液到每个孔中　　

　　4.在室温下避光孵育30分钟　

　　步骤4：　

　　染色后清洗样本可最大限度地减少背景信号　　

　　1.小心地吸出染色溶液　　

　　2.加入400μl缓冲液　　

　　3.小心地吸出缓冲液　

　　4.重复步骤2和步骤3至少一次　

　　步骤5：　

　　从一个边缘开始，用手或用镊子小心地取下硅胶垫圈。该步骤应以缓慢，稳定的进行，以避免损坏细胞层。

　　步骤6：　　

　　完成染色程序后，必须在用显微镜成像之前封固样品。该步骤还可防止样品脱水。　　

　　1.将载玻片侧面在干净的实验室湿巾上轻敲，去除样品中多余的介质。　　

　　2.将封固剂涂在样品上。用24 x 60毫米的盖玻片覆盖安装好的样品，小心地将盖玻片放到安装介质上，以避免夹住任何气泡。　　

　　Tip：建议使用硬化封片剂，如FluoroshieldTM (Sigma-Aldrich), Vectashield? (Vector Laboratories Inc.), or ProLong Antifade? (ThermoFisher Scientific)。　

　　3.等封片剂固定好。

　　步骤7：显微观察　

　　在可移除8孔腔室载玻片中免疫染色的MCF-7细胞的荧光显微镜检查。绿色：α-微管蛋白，红色：F-肌动蛋白（鬼笔环肽），蓝色：细胞核 (DAPI)。使用20倍物镜拍摄宽场荧光图像。　　

　　免疫荧光实验实例　

　　人眼的小梁网细胞，在 ibidi 8 Well Chamber 8孔可移除载玻片中。F-肌动蛋白丝显示为绿色；细胞核被 DAPI（蓝色）染色。图片由中国香港香港理工大学视光学院的Samantha Shan提供。　

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