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HUVEC在趋化载玻片上的3D免疫荧光染色细胞趋化实验
时间:2023-11-09 17:20:30  点击数:185次

  ibidi µ-Slide Chemotaxis细胞趋化载玻片对嵌入Matrigel®中的HUVEC(人脐静脉内皮细胞)进行免疫荧光染色的详细实验方案;在趋化性细胞向迁移之后,可通过免疫细胞化学染色研究了定向细胞迁移的形态学特征。  

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µ-Slide Chemotaxis

  实验材料准备:  

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  实验步骤:

  把HUVEC接种在50%Matrigel®中,并填充至µ-Slide Chemotaxis中,然后将其沿10%FCS梯度迁移24小时。采用免疫染色法观察内皮细胞在Matrigel®中定向迁移后的形态学特征。HUVEC的染色是直接在µ-Slide细胞趋化载玻片中进行的。在染色方案的所有步骤中,将60 µl的相应溶液分别添加到两个大储液池中。在孵育过程中,所有塞子均保持关闭状态,以免干扰通过观察通道的扩散。除非另有说明,否则所有步骤均在室温下进行。  

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  实验操作流程: 

  1) 从一边储液池中取出塞子,然后吸出培养基。在抽吸和冲洗步骤中,将塞子留在中央通道中。

  2) 用1x PBS洗涤→3x 10分钟

  3) 用4%多聚甲醛固定细胞和基质蛋白→1x 40分钟

  4) 用1x PBS洗涤→2x 10分钟

  5) 用0.2%Triton X-100 / PBS透化细胞→1x 20分钟

  6) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟

  7) 用1% BSA/PBS阻断非特异性抗原→过夜

  8) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟

  9) 添加一抗:单克隆抗VE钙黏着蛋白,小鼠(在1%BSA / PBS中为1:100)→在4°C下1x 24小时

  10) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟

  11) 添加二抗:山羊抗小鼠IgG(H + L),Alexa Fluor 680(在1%BSA / PBS中为1:50)→在4°C过夜

  12) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟

  13) 加入染色混合物→1x 40分钟

  i) 罗丹明phalloidin染色肌动蛋白丝(PBS中1:400)

  ii) Hoechst 33342对细胞核染色(1:100,PBS中0.5 µg/ml)

  14) 用1x PBS洗涤→6x 10分钟

  15) 将最后的PBS留在储液罐中并开始成像。

  免疫荧光图像是由共聚焦激光扫描显微镜获得,配以水物镜。

  重要提示:与标准染色方案相比,洗涤和染色步骤所需的培养时间更长。这是为了确保抗体通过凝胶充分扩散。 

  实验结果:

  HUVEC在Matrigel®基质中的免疫染色显示,相邻的细胞组优先形成细胞簇并作为集合体迁移。少数细胞呈单细胞迁移。

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  图中显示HUVEC在50%Matrigel®中的多细胞趋化性的细胞簇。固定后,对细胞进行细胞核(蓝色)、F-肌动蛋白(红色)和VE钙粘蛋白(青色)染色。白色箭头表示VE介导的细胞-细胞接触。当以多细胞单元组织时,细胞团簇表现出明显的前后不对称的群极化。迁移复合体较深区域的连续细胞没有极化。然而,这些细胞特征性地保留了VE钙粘蛋白介导的细胞-细胞接触。

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